引言

功能性消化不良（Functional Dyspepsia, FD）是一种常见的上消化道功能障碍性疾病，主要症状是餐后饱胀、早饱感、上腹痛或上腹烧灼感，但检查时找不到能解释这些症状的器官结FD以餐后饱胀、早饱、上腹痛为主要症状，缺乏器质性病变依据，全球患病率高，现有药物治疗效果有限且易复发。因此，从传统药物中探寻安全有效的疗法具有重要意义。甘草在中医常用于治疗脾胃虚弱、脘腹疼痛，现代研究证实其具有抗炎、抗溃疡、解痉等多重药理作用，但其治疗FD的具体成分与分子机制尚未明确。中药具有多成分、多靶点、多通路的特点，其复杂机制解析困难。网络药理学通过构建“药物—靶点—疾病”网络，可系统揭示中药作用机制；分子对接技术则能从分子层面验证相互作用。为此，本研究拟整合网络药理学与分子对接方法，筛选甘草治疗FD的活性成分、潜在靶点及关键通路，初步构建“成分—靶点—通路”调控网络，以阐明其潜在分子机制，为后续实验与临床提供依据。

1 材料与方法

1.1 甘草活性成分及作用靶点筛选

本研究使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以“甘草”为关键词查找它的所有化学成分。然后，根据中药成分在体内的吸收利用特点，设定筛选条件：口服生物利用度（OB）不低于30%，并且类药性（DL）不低于0.18，这样可以筛选出有较好成药潜力的活性成分。之后，通过TCMSP数据库收集这些活性成分对应的所有蛋白质靶点。最后，利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）把这些靶点蛋白的名称统一转换成标准的官方基因名（Gene Symbol），并且把物种限制为“人”（Homo sapiens）。

1.2 功能性消化不良疾病靶点收集

本研究以“Functional Dyspepsia”和“Non-ulcer Dyspepsia”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）和DisGeNET（https://www.disgenet.org/）这几个数据库中查找与FD相关的疾病靶点。然后，把从各个数据库找到的结果合并在一起，去掉重复的靶点，由此得到FD相关的疾病靶点集合。

1.3 甘草-FD共同靶点获取及网络构建

把甘草活性成分的靶点集合和FD疾病靶点集合，一起导入Venny2.1这个在线工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）制作韦恩图，找出两个集合中都有的靶点，这些就是甘草治疗FD的潜在作用靶点。接着，使用Cytoscape3.9.1这个软件生成“甘草活性成分-潜在靶点”的关系网络图。其中，点代表活性成分或者靶点，线代表它们之间有相互作用。

1.4 蛋白互作（PPI）网络构建与核心靶点筛选

把上面找到的共同靶点导入STRING11.5数据库（https://string-db.org/），把物种设为“人”，相互作用的最低可信度设为“中等（0.400）”，并且隐藏那些没有连接关系的孤立的点，这样就可以获得这些靶点之间蛋白质相互作用的网络信息。然后，把这个结果导入Cytoscape软件，使用软件里的“NetworkAnalyzer”工具来计算网络中每个点的拓扑学参数，主要包括：度值（Degree，表示连接数）、介数中心性（Betweenness Centrality，表示作为桥梁的重要性）和接近中心性（Closeness Centrality，表示与其他点的接近程度）。本研究初步以“度值>所有点度值中位数的2倍”作为主要标准，再结合其他参数，来筛选出网络中的核心靶点。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析

把筛选出来的核心靶点列表，导入DAVID6.8这个生物信息学数据库（https://david.ncifcrf.gov/），进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。GO分析包括三个方面：生物过程（Biological Process, BP）、细胞组分（Cellular Component, CC）和分子功能（Molecular Function, MF）。分析时，物种设为“人”，并且只保留P-value小于0.05的显著结果。最后，利用微生信这个在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）生成富集分析结果图，分别得到柱状图和气泡图。

1.6 分子对接验证

从1.1筛选出的活性成分里，选择在网络中连接度排名前3的核心成分，作为要对接的小分子配体。从1.4筛选出的核心靶点里，选择度值排名第1的核心靶点，作为受体蛋白。然后，从RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载这个受体蛋白的三维晶体结构文件，用PyMOL软件去掉结构里的水分子、原来的配体等不需要的部分，再用AutoDockTools1.5.7软件给蛋白质加上氢原子、计算电荷。同时，从TCMSP数据库下载配体小分子的3D结构，也用AutoDockTools进行能量最小化和电荷计算。接着，设置一个对接的“盒子”，这个盒子要能完全包住受体蛋白上可能发生结合的活性口袋区域。之后，使用AutoDock Vina1.1.2软件进行分子对接模拟计算，并记录下每次对接的结合能（单位是kcal/mol）。结合能的值越低，就说明配体和受体结合后的构象越稳定。最后，用PyMOL和LigPlot+软件把能量最低、也就是最好的对接构象可视化展示出来，并分析它们之间是靠什么作用力结合的，比如氢键、疏水作用等。

1.7 虚拟实验设计（基于预测结果的分子生物学实验思路）

为了将网络药理学的预测结果转化为一个可以实际验证的科学假设，本文设计了一套虚拟的细胞实验方案：用人正常的胃上皮细胞（GES-1）作为实验模型，用脂多糖（LPS）或者肿瘤坏死因子-α（TNF-α）来刺激细胞，建立一个模拟FD相关的细胞炎症或损伤模型。实验分组设置为：空白对照组、模型组、以及用甘草主要活性成分（比如甘草酸、甘草次酸）处理的干预组。然后，可以通过以下几种分子生物学技术来进行验证：①用蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测PI3K、p-Akt、Akt、IL-6、TNF-α这些核心靶点蛋白的表达水平；② 用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测相关基因的mRNA表达量；③用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞培养上清液里炎症因子（如IL-6, IL-1β, TNF-α）的含量；④用CCK-8法检测细胞的活力；⑤用流式细胞术检测细胞的凋亡率。

2结果

2.1 甘草活性成分及靶点筛选

从TCMSP数据库一共找到180个甘草的化学成分。按照OB≥30%和DL≥0.18的标准筛选后，最终得到19个符合条件的活性成分，包括槲皮素、山奈酚、甘草苷、异甘草素、甘草酸、甘草次酸等。然后通过TCMSP和UniPort数据库进行匹配和转换，去掉重复和没有对应基因名的靶点，最后得到了175个甘草活性成分的作用靶点。

2.2 FD疾病靶点与共同靶点获取

从GeneCards、OMIM等数据库一共找到了1407个与FD相关的疾病靶点。把175个甘草作用靶点和1407个FD疾病靶点放在一起比较，取它们的共同部分，最后得到了134个甘草治疗FD的潜在共同靶点。

2.3 “活性成分-靶点”网络与PPI网络分析

本研究构建的“甘草活性成分—共同靶点”网络图，一共包含153个点（19个成分点和134个靶点）和423条连接线。这个网络显示出“多种成分对应多个靶点”的特点，其中槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇这几个成分连接的靶点数量最多，这说明它们可能是甘草发挥药效的关键成分。

把134个共同靶点导入STRING数据库构建蛋白质相互作用网络，这个网络包含了134个点和1643条连接线，每个点平均有24.5条连接。把这个网络导入Cytoscape软件进行分析，本文以“度值>49”（这是所有点度值中位数的2倍）为主要标准，筛选出了10个核心靶点，包括AKT1、IL6、TP53、VEGFA、JUN、CASP3、MYC、EGFR、MMP9、PTGS2。这些靶点在网络中处于连接非常多的中心位置，很可能在整个调控网络中起着关键作用。

2.4 GO功能与KEGG通路富集分析

GO富集分析一共得到了746个显著的结果条目（其中生物过程BP有583条，细胞组分CC有59条，分子功能MF有104条）。BP主要涉及细胞对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对药物的反应、细胞增殖的正向调控、细胞凋亡过程的负向调控等。CC主要涉及膜筏、膜微区、细胞质膜、细胞外间隙等。MF主要涉及细胞因子受体结合、蛋白激酶结合、蛋白激酶活性、转录因子结合等。

KEGG通路富集分析筛选出了152条显著通路（P值<0.05）。这些通路主要和以下三个方面有关：①癌症相关通路（比如前列腺癌、癌症中的蛋白聚糖通路）；②炎症与免疫相关通路，例如PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、Th17细胞分化通路、T细胞受体信号通路；③病毒感染相关通路（比如乙型肝炎、人巨细胞病毒感染）。其中，PI3K-Akt信号通路富集到的相关基因数量最多，这个通路与炎症、细胞存活和增殖关系非常密切，它可能是甘草治疗FD的一个核心作用通路。

2.5 分子对接验证结果

本研究选取了在网络中连接度最高的三个核心活性成分——槲皮素、山奈酚、甘草次酸作为配体小分子，选取了度值排名第一的核心靶点AKT1（它的蛋白质结构数据库编号是3O96）作为受体蛋白，进行了分子对接。结果显示，这三种活性成分与AKT1蛋白的结合能分别是-8.5 kcal/mol、-8.1 kcal/mol、-9.0 kcal/mol，它们的结合能都小于-5.0 kcal/mol，这说明它们与AKT1都有很强的自发结合能力。其中，甘草次酸的结合能最低，意味着它结合得最稳定。这些成分主要是通过形成氢键、产生疏水作用等方式，与AKT1蛋白活性口袋里的某些关键氨基酸残基结合。这个结果验证了本文中网络预测的可靠性。

3讨论

这项研究基于网络药理学和分子对接技术，初步揭示了甘草通过“多成分、多靶点、多通路”来治疗FD的潜在分子机制。

在活性成分方面，槲皮素、山奈酚、甘草次酸等被预测为关键成分。这个预测和已有的研究是吻合的：槲皮素和山奈酚是大家公认的黄酮类抗炎抗氧化剂，能够减轻胃肠道的炎症和氧化应激损伤；甘草次酸是甘草里主要的三萜皂苷元，已经被很多研究证实具有明显的抗溃疡、抗炎和解除平滑肌痉挛的作用。本研究的“成分-靶点”网络分析，为这些成分如何协同作用来治疗FD提供了一个系统的视角。

在核心靶点方面，识别出了AKT1、IL6、TP53、VEGFA等靶点。AKT1是PI3K-Akt信号通路的核心蛋白，它调控细胞的存活、增殖和新陈代谢，它的功能失常与胃肠道动力紊乱和内脏感觉过敏有关。IL6是一种重要的促炎细胞因子，在FD患者，特别是那些伴有焦虑、抑郁情绪的患者体内，它的水平常常是升高的。TP53参与细胞的应激反应和凋亡调控，VEGFA则与胃肠黏膜的保护和修复有关。这些靶点共同指向了炎症调节、细胞保护、神经免疫调节等FD发病的关键环节。

在信号通路方面，富集分析结果强烈地提示，PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路和IL-17/Th17细胞分化通路是甘草发挥作用的关键途径。PI3K-Akt通路被普遍认为在连接生长因子、细胞因子信号与细胞功能之间起着核心枢纽作用。抑制PI3K/Akt通路可以减轻炎症并调节胃肠平滑肌的功能。TNF-α是一种经典的促炎因子，它直接参与导致胃肠黏膜炎症和内脏疼痛的过程。Th17细胞以及它产生的细胞因子IL-17，在胃肠道黏膜免疫和慢性炎症中扮演着重要角色。甘草的活性成分可能通过同时影响这些通路，来降低促炎因子（如IL-6，TNF-α，IL-17）的水平，提高抗炎因子的水平，并且促进受损胃黏膜细胞的修复和存活，从而综合改善FD的各种上腹部症状。

分子对接的结果从计算层面证实了核心成分与核心靶点（比如甘草次酸与AKT1）之间确实存在稳定的结合潜力，这为上面的网络预测提供了有力的支持，也提示我们，直接调控AKT1等激酶的活性，可能是甘草有效成分的一种作用方式。

这项研究也有一些不足：首先，网络药理学的预测完全依赖于现有的数据库，这些数据库可能存在数据不全或有误差的情况；其次，本文采用的筛选标准（OB和DL）可能会漏掉一些通过其他途径起效或者在局部起效的成分；最后，目前所有的结论都是计算机模拟预测出来的，迫切需要后续的体外细胞实验和体内动物实验来加以验证。本文在1.7部分设计的虚拟实验方案，就为将来的实际验证工作提供了一条清晰的思路。

4结论

这项研究使用了网络药理学、分子对接和生物信息学分析方法，预测了甘草治疗功能性消化不良的潜在有效成分（如槲皮素、山奈酚、甘草次酸等）、核心作用靶点（如AKT1、IL6、TP53等）以及关键信号通路（如PI3K-Akt、TNF、IL-17信号通路）。研究初步说明，甘草可能是通过发挥抗炎、调节免疫、保护胃黏膜、促进细胞存活等多种作用，并且这些作用是通过多个靶点和多条通路协同实现的。这项研究的结果，为了解甘草治疗FD的科学原理提供了一个新的角度，也为接下来开展有针对性的分子生物学实验研究，以及开发甘草相关的药物制剂，打下了理论基础。

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