引言

牙周炎是一种由菌斑生物膜诱发的慢性破坏性疾病，病程迁延、进展缓慢，主要表现为牙周支持组织炎症加重、牙槽骨持续吸收及结构稳态失衡。近年来研究发现，牙周组织中存在一类高表达血小板-内皮细胞黏附分子（Platelet endothelial cell adliction molecule-1，PECAM-1/CD31）和内皮黏蛋白（Endomucin，EMCN）的特异性毛细血管亚型—H型血管。该类血管在骨形成、造血维持及骨相关疾病修复中发挥重要作用，兼具促进血管生成和成骨的双重功能，与成骨活性密切耦联，其数量变化直接影响牙槽骨改建。因此，维持或恢复H型血管结构与功能对牙槽骨再生至关重要。氧化应激是牙周炎的重要病理机制之一。过量活性氧（Reactive Oxygen species，ROS）不仅可直接损伤牙周膜细胞及血管内皮，还可诱导炎症因子表达、促进成纤维细胞凋亡和破骨细胞活化，加速组织退变。内质网应激（Endoplasmic reticulum Stress，ERS）在此过程中放大炎症与损伤信号，其中IRE1-XBP1通路尤为关键。剪接型X盒结合蛋白1（X-box binding protein1，XBP1-S）作为ERS核心转录因子，其异常激活可加剧氧化应激和组织破坏，在牙周炎微环境中具有重要调控意义。中医药在抗氧化、抗炎及维持血管内皮稳态方面具有多靶点优势。丹参活性成分丹参酮IIA、丹参素可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化损伤。复方丹参滴丸（Compound danshen dripping pills，CDDP）作为含丹参成分的经典制剂，在心脑血管及微血管病变中表现出抗炎、抗氧化和改善微循环的作用。基于上述机制，推测CDDP可能通过调控XBP1介导的氧化应激，促进H型血管生成，改善血管-骨耦联，从而有效缓解牙周炎所致牙槽骨丢失。

1 材料与方法

1.1研究对象

研究选用健康成年雄性野生型C57BL/6J小鼠（8周龄，体重20-23 g），由正规实验动物中心提供。选择雄性小鼠以避免雌激素波动对牙周组织炎症反应和骨代谢的影响。所有动物实验前适应性饲养7天，饲养条件为恒温（22±2℃）、恒湿（55±10%）、12 h明暗交替，自由摄食饮水。实验严格遵循《实验动物管理条例》，经实验动物伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1牙周炎动物模型建立

采用经典磨牙颈部结扎法制备模型，无菌6号丝线绕小鼠上颌右侧第二磨牙颈部结扎，位于龈沟内侧并紧贴牙面，促进食物及菌斑堆积，诱发局部慢性炎症。操作在麻醉下进行，结扎后每日检查丝线位置，松脱及时重新结扎。该方法可在2周内稳定诱导牙龈红肿、炎症细胞浸润、牙槽骨吸收等牙周炎病理改变。结扎2周后通过肉眼观察、探针触诊及Micro-CT扫描初步确认模型建立成功。

1.2.2 药物干预

干预药物为复方丹参滴丸，根据临床成人常用剂量及小鼠体表面积换算，确定灌胃剂量为150 mg/kg・d。药物以适量生理盐水溶解后经口灌胃，每日1次，连续干预2周。正常组与模型组给予同体积生理盐水对照，给药时间保持一致，减少昼夜节律影响。药物干预从建模第2天开始，持续14天，期间观察动物健康状况，异常个体剔除并记录。

1.2.3组织取材与处理

实验结束后，戊巴比妥钠麻醉动物，心脏灌注生理盐水及4%多聚甲醛体内固定，取上颌骨整体组织，去除多余软组织后置于4%多聚甲醛中进一步固定48小时。部分样本经EDTA脱钙后用于包埋与切片，其中石蜡切片厚度4 μm，用于DCFH-DA荧光探针检测；冷冻组织切片厚度8–10 μm，用于免疫荧光标记；另一部分样本未经脱钙直接用于Micro-CT扫描。

1.2.4 实验检测方法

（1）骨组织结构分析：采用高分辨率Micro-CT系统（Scanco Micro-CT50，瑞士）对小鼠右上颌第二磨牙区成像分析。扫描参数：电压70 kVp，电流114 μA，分辨率10 μm/voxel，扫描范围覆盖第一磨牙及其邻近牙槽骨区。重建三维图像后，以CEJ至ABC区域为感兴趣区（ROI），分析骨体积分数（BV/TV）、釉牙骨质界至牙槽嵴距离（CEJ-ABC）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）等参数。

（2）H型血管检测：H 型血管检测：上颌骨脱钙后包埋，8 μm冷冻切片用于免疫荧光检测。切片通透后5% BSA封闭1 h，孵育抗小鼠CD31和EMCN一抗（各1:200），4℃过夜；次日加入Alexa Fluor488和594标记的荧光二抗，避光孵育1 h后DAPI染核，PBS洗片封片。共聚焦显微镜下采集图像，随机选取3–5个视野，统计CD31⁺EMCN⁺双阳性血管占总 CD31⁺血管比例。

（3）内皮细胞功能实验：人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）培养于ECM培养基，炎症模型加入200 μM脂多糖（LPS）刺激24 h，干预组同时加入10%复方丹参滴丸药物血清。迁移实验：HUVEC接种6孔板，融合后划痕，PBS清洗，换不同处理培养基，记录0 h与24 h划痕图像，ImageJ测量愈合距离计算迁移率。成管实验：Matrigel铺96孔板37℃固化，接种处理组HUVEC（2×10⁴cells/well），孵育6 h，显微镜观察拍照，量化分支数、闭合环路与总管腔长度。

（4）氧化应激与内质网应激检测：提取牙周组织总蛋白，RIPA裂解液裂解，冰浴震荡30 min后12000 rpm离心15 min收集上清，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE分离并转膜至PVDF膜，封闭后孵育XBP1-S一抗过夜，次日加HRP标记二抗，ECL显色，Image J成像系统检测灰度。组织内ROS水平采用DCFH-DA荧光探针检测，脱钙石蜡切片脱蜡水化后，滴加10 μM DCFH-DA，37℃暗处孵育30 min，PBS洗涤后共聚焦显微镜采集图像，ImageJ半定量分析。牙囊间充质干细胞（Dental follicle mesenchymal stem cells，DFMSCs）培养于含10% 胎牛血清的α-MEM培养基，200 μM LPS刺激24 h，干预组同时加入10%药物血清，DCFH-DA染色后荧光显微镜观察采集图像，定量分析ROS水平。

1.3观察指标

骨量学指标：骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数目（Tb.N）、CEJ-ABC距离；内质网应激指标：XBP1-S蛋白表达；氧化应激指标：ROS表达水平；血管生成指标：H 型血管数量与占比；细胞功能性指标：成管能力、迁移修复能力。所有检测遵循标准操作流程。

1.4统计学分析

数据采用SPSS26.0 软件分析，计量资料以x̄±s表示，两组间比较用双尾非配对t检验，多组比较用单因素方差分析结合Turkey事后检验。p值＜0.05、p值＜0.01、p值＜0.001、p值＜0.0001分别标注“*”、“**”、“***”、“****”表示显著性差异。

2结果

2.1复方丹参滴丸缓解牙周炎相关的牙槽骨吸收

Micro-CT分析显示，模型组（Periodontitis）牙槽骨明显吸收，BV/TV减少、Tb.Th变薄、Tb.N减少、CEJ-ABC距离显著增加；CDDP干预组骨量指标显著改善，BV/TV及Tb.Th 恢复，CEJ-ABC距离缩小（表1）。三维重建图像显示，对照组（Control）牙槽骨轮廓清晰、骨量丰富，模型组骨高度下降、结构断裂，CDDP组结构明显优于模型组（图1A）。免疫荧光染色显示，牙周炎组根方牙槽骨中CD31、EMCN数量减少，CDDP组显著增多（图1B），统计分析支持该差异（图1C），提示CDDP可能通过调节炎症微环境、改善血管-骨耦联缓解牙槽骨丧失。

组别	CEJ-ABC距离（mm）	BV/TV(%)	Tb.Th(mm)	Tb.N
Control	0.25±0.03	39.2±2.1	0.18±0.01	3.45±0.22
Periodontitis	0.56±0.05*	21.4±1.8*	0.12±0.01*	2.12±0.17*
Periodontitis+CDDP	0.32±0.04#	34.6±1.9#	0.16±0.01#	3.02±0.18#

注：*与对照组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05。

2.2 CDDP改善LPS诱导的内皮细胞功能损伤

对照组细胞迁移能力良好，24小时内划痕区域几乎愈合；LPS刺激组细胞迁移受阻，划痕宽度变化小；CDDP干预组细胞迁移能力部分恢复，划痕面积明显缩小（图2A-B）。成管实验中，对照组HUVEC形成丰富完整的毛细血管样结构，LPS处理组成管结构稀疏、分支减少，CDDP干预组分支数和闭合环路数量显著回升（图2C-D），提示其可缓解氧化 /炎性环境下的内皮功能障碍。

2.3复方丹参滴丸促进H型血管形成

免疫荧光染色显示，Control组细胞形态完整、分支丰富，CD31与EMCN广泛共表达，形成典型H型血管样结构；LPS处理组血管样结构破坏严重，CD31与EMCN表达减少，管腔稀疏断裂；CDDP干预组血管分支明显恢复，CD31与EMCN共表达信号显著提升，管状结构重建（图3），表明CDDP能有效促进H型血管形成与成熟。

2.4 CDDP抑制氧化应激，降低ROS水平

ROS检测显示，与对照组相比，LPS刺激组DFMSCs内ROS水平显著升高，荧光信号增强；CDDP干预组ROS荧光强度显著减弱（图4A）。牙槽骨组织ROS检测表明，牙周炎模型组ROS信号明显增强，CDDP治疗组显著减轻ROS累积（图4B-C）。Western blot检测显示，牙周炎小鼠牙槽骨组织中XBP1-S表达水平高于对照组，CDDP干预后显著下调（图4D），提示CDDP可通过抑制内质网应激信号通路，减轻氧化应激损伤。

组别	ROS强度（相对荧光单位）	CD31+EMCN+比例（%）
Control	100±12	32.5±3.4
LPS（模型组）	265±24*	12.3±2.1*
LPS+CDDP	138±16#	26.1±2.7#

注：*与Control比较，P<0.05；#与LPS组比较，P<0.05。

3讨论

3.1复方丹参滴丸改善牙槽骨丢失与氧化应激的作用

本研究结果显示，复方丹参滴丸干预可显著缓解牙周炎小鼠牙槽骨吸收，Micro-CT分析可见CEJ-ABC距离缩短、BV/TV升高及骨小梁结构改善，且体内外实验均证实其能显著降低ROS水平，表明其具有明确的抗氧化与骨保护作用。牙周炎中，持续炎症刺激导致活性氧大量生成，氧化应激通过损伤成骨细胞、抑制血管内皮功能、促进破骨细胞活化加速牙槽骨丢失。已有研究表明，丹参酮类成分可激活Nrf2/HO-1信号通路，增强抗氧化防御能力；丹参素能改善线粒体功能，抑制铁死亡相关通路，降低ROS积累。本研究ROS检测结果与上述机制一致，提示复方丹参滴丸可能通过多成分协同激活抗氧化通路，改善牙周炎局部氧化应激微环境。此外，丹参制剂在改善微循环、减轻炎症反应方面的已知作用，也为其调控牙周微血管与骨代谢提供了支持。丹参注射液在口腔领域的应用研究也证实了其能促进组织修复与再生。

3.2 XBP1-氧化应激通路在牙周炎中的作用

内质网应激是炎症与氧化应激的重要交汇点，IRE1α-XBP1信号轴在细胞稳态调控中起核心作用。本研究发现，牙周炎模型中氧化应激水平显著升高，伴随内质网应激相关蛋白表达异常，复方丹参滴丸干预后上述改变明显改善，提示XBP1相关通路可能参与牙周炎病理过程。既往研究表明，XBP1作为未折叠蛋白反应的关键转录因子，异常激活可放大氧化应激和组织损伤；在牙周炎中，XBP1可参与免疫细胞代谢调控和炎症微环境塑造，如外泌体 miR-205-5p通过靶向XBP1调节Th17/Treg平衡，这与本研究观察到的氧化应激升高和组织损伤结果吻合。在视网膜和神经系统疾病中，XBP1也被证实通过调控内质网应激与氧化应激通路参与组织损伤与修复，补虚活血中药可通过调节XBP1等蛋白表达发挥保护作用，为牙周炎中类似机制提供了参考。本研究虽未直接通过基因干预验证XBP1的因果关系，但结合相关检测结果，提示复方丹参滴丸可能通过调控XBP1介导的应激反应，降低氧化损伤，改善牙周炎相关组织破坏，未来可通过XBP1特异性干预进一步明确其关键作用。关于NLRP3炎症小体在代谢性肝病中的机制研究也为理解炎症-应激网络提供了重要视角。

3.3 H型血管、血管骨耦联与中医药调控

血管-骨耦联是骨稳态维持的重要机制，H型血管作为高度表达CD31和EMCN的特殊血管亚型，与成骨细胞活性和骨形成密切相关，可通过提供氧气、营养及信号分子直接促进骨形成。本研究通过CD31/EMCN双免疫荧光证实，牙周炎模型中H型血管比例显著下降，复方丹参滴丸干预可明显促进其恢复，提示其对血管骨耦联具有积极调控作用。在牙周炎-牙槽骨缺损模型中，H型血管生成受PDGF-BB/PDGFR-β等信号通路调控，其数量减少与炎症持续和骨吸收加重密切相关；Gli1+间充质干细胞对颌骨发育中H型血管的维持作用及机制也已得到阐明。本研究结果显示，复方丹参滴丸在降低氧化应激的同时促进H型血管生成，可能通过改善内皮功能和血管微环境间接增强成骨能力。既往研究也报道丹参类制剂可促进VEGF等血管相关因子表达，加速血管修复和新生，甚至通过ERK等信号通路促进干细胞成骨分化。而中医药在调控血管稳态、抑制氧化应激及改善组织微环境方面的多靶点优势，也为牙周骨重建提供了新的干预思路。综上所述，复方丹参滴丸具有显著的抗牙周炎骨丢失作用，其潜在机制是通过抑制氧化应激以恢复内皮细胞功能，促进H型血管的特异性生成，进而优化血管-骨耦联，最终改善由牙周炎引起的骨缺损。

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