引言

冷冻保存技术是把生物样本放到-196℃左右的液氮这类超低温环境里，让细胞几乎停止代谢活动，以此实现生物材料的长期保存。目前它已经是辅助生殖医学、组织工程、生物样本库建设及临床移植等领域里不能缺少的技术手段。辅助生殖领域里，精子、卵母细胞的冷冻保存给不孕不育患者提供了保存生育力的机会，组织工程和再生医学领域中，血管、神经、肌腱等组织的低温保存能给同种异体移植提供材料来源，生物样本库建设工作中，细胞和组织的规模化冻存能为基础研究和临床应用准备好资源基础。但冷冻保存时，冰晶形成、渗透压休克、氧化应激等损伤因素，对冻存后细胞的存活率和功能完整性有比较大的影响。冰晶形成会对细胞膜、细胞器造成机械性损伤，冷冻时细胞外液析出冰晶，会让未冻结部分渗透压升高，使得细胞严重脱水，复温时冰晶重结晶会让损伤进一步加重，冷冻过程产生的活性氧还会让脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤出现。为降低这些冷冻损伤，必须给样本添加冷冻保护剂。冷冻保护剂是能保护细胞不被冷冻伤害的化合物，它能靠多种机制实现保护效果，比如让溶液冰点降低，抑制冰晶生成，稳定细胞膜结构，调节渗透压，还能清除自由基等。1949年Polge等人发现甘油能给精子提供冷冻保护后，研究者们就不断探索开发各类冷冻保护剂，先是用甘油、二甲基亚砜，后来发展到糖类、高分子聚合物，再到近年出现的抗冻蛋白、深共晶溶剂、纳米材料等新型保护剂。不同生物样本对冷冻保护剂的敏感度存在比较大的差异，理想的冷冻保护剂要具备低毒性、高渗透性、强玻璃化形成能力以及良好的生物相容性。针对特定样本筛选优化冷冻保护剂配方，一直是冷冻保存领域的研究热点。本文整理了近几年国内外关于冷冻保存技术的研究文献，先梳理冷冻保护剂的作用原理、类别划分，以及它在各类生物样本里的应用情况，再总结当前研究碰到的主要难题，最后对后续发展方向做出展望，给相关研究和临床应用提供参考。

1 冷冻保护剂的作用机制

1.1 冰晶形成抑制

冰晶的形成与生长是造成冷冻损伤的最主要原因。降温时，细胞外液先出现冰晶，没冻结的部分溶质浓度上升，形成渗透压梯度，使得细胞内的水分向外流出。要是降温速度太快，细胞内水分没法及时流出，就会在细胞内部生成冰晶，直接破坏细胞膜和细胞器结构。

冷冻保护剂不让冰晶长出来的原理主要有这几点：拉低溶液结冰温度、让溶液黏度大一些、打乱水分子的有序排列、阻止冰晶生长。Min Lin等从分子层面解释了冷冻保护剂抑制冰晶的原理，他们的研究显示，这类保护剂能打破水的四面体结构排列，让四面体的熵值上升；另外，保护剂分子会和水分子形成强氢键，限制水分子的平移与旋转，让氢键网络重排的活化能垒有所提升。这种同时调控水结构和动力学的方式，是冷冻保护剂阻止冰晶成核的核心原因。玻璃化冷冻时，高浓度的冷冻保护剂会让溶液降温时直接变成非晶态的玻璃态，完全不会出现冰晶。赵恒等梳理了过冷保存技术的研究情况，提出优化冷冻保护剂的搭配组合，能让器官在低于冰点的温度下维持过冷状态，延长保存时间的同时，避免冰晶造成的损伤。

1.2 渗透压调节

渗透调节是冷冻保护剂的另一核心保护机制，本文依照细胞膜的透过性，将冷冻保护剂划分成渗透性、非渗透性两类，两类物质相互配合，维持冷冻阶段的渗透平衡。

像二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇这类渗透性冷冻保护剂，分子量比较小，能随意穿过细胞膜，替换掉细胞里的部分水分，减少细胞内可被冻结的水量，让细胞内部不会出现冰晶。这类保护剂还能提升细胞膜的流动性，增强细胞耐受低温的能力。非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉，它们分子量比较大，没办法穿过细胞膜，只能靠提升细胞外液的渗透压，促使细胞脱水，降低细胞内形成冰晶的概率。周雪萍等开展淋巴细胞冷冻保存研究时发现，把渗透性保护剂二甲基亚砜，和非渗透性保护剂聚乙二醇、牛血清白蛋白搭配使用，能提高淋巴细胞解冻后的回收率，降低凋亡率，这就是渗透性与非渗透性保护剂共同作用的效果。

1.3 氧化应激防护

细胞受损的一个重要因素，是冷冻环节引发的氧化应激。低温会让细胞能量代谢出现紊乱，线粒体没法正常工作，电子传递链的泄漏量变大，使得活性氧的生成量超标。细胞自身的抗氧化系统活性降低，氧化和抗氧化的平衡被打破，还会让脂质过氧化、蛋白质氧化以及DNA损伤等问题出现。

有一部分冷冻保护剂带抗氧化功能，要么直接清理自由基，要么激活细胞自身的抗氧化系统。陆清芳等做小鼠卵巢组织玻璃化冷冻实验时，往冷冻保护剂里加了抗氧化剂MnTBAP（锰卟啉类超氧化物歧化酶模拟物），结果发现这种物质能激活Nrf2/HO-1抗氧化通路，让超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性有提升，丙二醛含量降低，细胞凋亡和纤维化的情况也有减少。胡涛涛等开展猪卵巢皮质组织冷冻实验，加入异甘草素后，也验证了抗氧化剂能优化冷冻保存效果，加100μM异甘草素可以抑制组织整体活性氧水平，减少细胞凋亡。赵程禹等整理了家畜精液冷冻保存的相关技术，把各类抗氧化剂的应用情况做了系统梳理，涉及酶类抗氧化剂（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）、维生素类（维生素E、维生素C）、植物提取物（白藜芦醇、茶多酚）以及纳米材料等，这些物质都能提升精子冷冻后的质量。

2 冷冻保护剂的分类

2.1 渗透性冷冻保护剂

能自由穿过细胞膜的小分子化合物，就是渗透性冷冻保护剂，这类物质主要有二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇等。

在各类渗透性冷冻保护剂里，二甲基亚砜是用得最多、相关研究也最广的一种，能用来冻存多种细胞和组织。王清芳等通过研究确认，添加二甲基亚砜的冷冻保护剂，对脐带间充质干细胞、脐血单个核细胞、NK细胞和CIK细胞都有不错的冻存作用，冻存后的细胞活率、表面标志物以及功能活性，都没有出现明显改变。但二甲基亚砜有细胞毒性，这是它投入临床应用的最大阻碍，特别是用于临床移植的细胞产品，移植前必须把它去除，让操作流程变得更复杂。甘油是最早投入使用的冷冻保护剂，目前在红细胞和精子的冷冻操作中应用范围比较大。Akalabya Bissoyi等开展禽类红细胞冷冻研究时，对比了甘油和聚两性电解质的保护作用，结果发现聚两性电解质搭配低浓度二甲基亚砜，能让细胞冻后恢复率更高。蔡超操等针对人小口径动脉深低温保存做研究，对比了二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇这四种渗透性保护剂的效果，发现40%二甲基亚砜组和40%甘油组的血管组织结构保存得最完整，内皮细胞呈连续排列状态，内弹性膜和平滑肌的结构也保持良好。

胚胎和卵巢组织冷冻工作里，乙二醇、丙二醇是比较常用的保护剂。戴依娜针对神经组织开展玻璃化保存研究，把四种保护剂的作用做了对比，得出30%乙二醇对指固有神经的保护效果最好，对应的神经纤维排列规整紧密，活细胞荧光强度最高，神经生长因子的表达量也处于最高水平。屠平光等研究猪合子期胚胎的玻璃化冷冻，设置20%乙二醇+20%丙二醇、20%乙二醇+20%二甲基亚砜两组保护剂做对照，最终数据显示，前一组的胚胎卵裂率、囊胚率都比后一组好很多，说明丙二醇更适配猪合子期胚胎的玻璃化冷冻需求。

2.2 非渗透性冷冻保护剂

非渗透性冷冻保护剂的分子量比较大，没法穿过细胞膜，这类物质主要有糖类，比如蔗糖、海藻糖、葡萄糖，还有高分子聚合物，比如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚两性电解质，以及蛋白质类，比如血清白蛋白、抗冻蛋白。

糖类保护剂可稳定细胞膜结构，调节细胞渗透压，像海藻糖这类糖类还能起到膜保护作用。胡涛涛针对猪卵巢皮质开展冷冻研究，把0.1M蔗糖、0.5M蔗糖、0.1M海藻糖和0.5M海藻糖当作非渗透性保护剂对比效果，最终得出0.1M海藻糖组的卵泡结构正常占比最高，比蔗糖组表现更好。陈丽羽在肠道菌群保存相关研究中测试了多组保护剂配方，发现5%海藻糖，以及5%蔗糖+5%菊粉+1%半胱氨酸盐酸盐的复合保护剂，都能提高肠道菌群的存活率，且复合保护剂对厌氧菌的保护效果更优。

最近几年，高分子聚合物受到的关注比较大。Bissoyi等的研究显示，聚两性电解质属于大分子冷冻保护剂，能让细胞内的冰晶形成量减少，和10%二甲基亚砜一起用的话，禽类红细胞冷冻后的恢复率能到90%上下，比传统甘油配方好，特别是经历6个月的长期储存后，这种优势会大一些。Takuya Kikuchi等针对NK细胞冷冻开展研究时发现，把脯氨酸、海藻糖和葡聚糖40组合使用，没能阻止NK细胞杀伤活性下降，而且海藻糖和葡聚糖40之间存在负相互作用，这说明要谨慎优化高分子保护剂的组合方案。

2.3 新型冷冻保护剂及功能性添加物

为了降低毒性、提高保护效果，研究者在冷冻保存技术进步后，持续开展新型冷冻保护剂和功能性添加物的探索。

抗冻蛋白是近几年的热门研究方向，这类蛋白最早在极地鱼类体内被发现，可附着在冰晶表面，阻止冰晶生长与重结晶。赵恒等梳理了抗冻蛋白在过冷保存场景中的应用情况，提到这类蛋白能抑制复温时的冰晶重结晶，降低冰晶对细胞和组织的损伤。深共晶溶剂是另一类新式保护剂，Rahel Befekadu等针对血小板冷冻保存开展研究，测试了氯化胆碱与甘油混合而成的深共晶溶剂作为附加冷冻保护剂的效果，结果显示添加10%该溶剂搭配可控速率冷冻法，血小板冻后回收率能超过85%，线粒体膜电位和体外活化状态和传统二甲基亚砜组比较大，这为开发不含二甲基亚砜的冷冻方案提供了新方向。纳米技术也被用到冷冻保存领域，磁性纳米颗粒辅助复温技术能让样本均匀快速复温，避免复温时出现冰晶重结晶损伤，赵恒等提到，这项技术有可能解决大体积样本玻璃化冷冻复温不均的问题。植物提取物作为天然抗氧化剂正受到关注，赵程禹等梳理了植物提取物在精液冷冻中的应用，涉及白藜芦醇、茶多酚、黄芩苷等物质，这些天然产物能通过清除自由基、抑制脂质过氧化、保护膜完整性等方式，优化精子冻后质量，胡涛涛在猪卵巢皮质冷冻实验中证实，添加100μM异甘草素（从甘草中提取的黄酮类化合物）能降低组织活性氧水平，减少细胞凋亡。

3 冷冻保护剂在不同生物样本中的应用

3.1 生殖细胞与胚胎的冷冻保存

辅助生殖技术和遗传资源保护都要依赖生殖细胞冷冻保存技术。当前精子冷冻技术比较成熟，不过不同物种、不同类型的精子，对冷冻保护剂的反应并不一样。

关于人类精子冷冻，沙玲娜等整理了该领域的研究成果，目前主流方案是混用渗透性保护剂（甘油、二甲基亚砜、乙二醇）和非渗透性保护剂（蛋黄、糖类），处理微量精子和睾丸穿刺精子时，得优化载体和保护剂浓度来提升回收率。Karekin D. Esmeryan等尝试了不用冷冻保护剂的人精液冷冻方式，完成了比较大体积精液的无保护剂冷冻，给临床简化操作、规避保护剂毒性提供了新方向。家畜精液冷冻的相关研究范围大一些。赵程禹等全面梳理了家畜精液冷冻技术，明确氧化应激是冷冻损伤的核心因素，添加抗氧化剂能提升冻后精液质量。涂枫等梳理了猪精液冷冻保护剂的研究情况，分析了两类保护剂的实际应用状态。赵锦辉等围绕羊精液冷冻，解析了冷冻损伤的分子机制，同时整理了对应的保护方法。邵乐等开展兔精液冷冻研究时发现，兔精子结构特殊，对低温耐受性差，要优化保护剂组合和冷冻流程。卵母细胞和胚胎冷冻可帮女性保存生育力。Shiyu Zhao等用低浓度冷冻保护剂冷冻小鼠卵母细胞，发现多种保护剂配合使用，能实现低毒性的高效保存。尉国澳等、翟亚莹等分别梳理了牛胚胎冷冻技术的进展，对比程序化冷冻和玻璃化冷冻的优劣，指出当前发展方向是玻璃化冷冻搭配高效低毒保护剂。

3.2组织与器官的冷冻保存

相比单细胞悬液的保存，组织冷冻保存的难度比较大，要考虑细胞外基质结构、多细胞类型以及物质传递等多种因素。

卵巢组织冷冻技术，能帮女性尤其是癌症患者留住生育的可能。李淼等梳理了人卵巢组织玻璃化冷冻的相关研究，提到这种冷冻方式在卵巢组织保存里用得越来越多，还得优化保护剂的渗透条件和降温的速度。陆清芳给小鼠卵巢组织冷冻时加了MnTBAP，让冻后的组织质量有了改善，卵泡形态正常率和存活率也有提升。胡涛涛针对猪卵巢皮质组织，完成了冷冻载体和保护剂组合的系统优化，得出用冻存管当载体，搭配15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.1M海藻糖+100μM异甘草素的方案，保存效果是最好的。血管冷冻保存技术，能给同种异体血管移植提供材料。王鐥等梳理了血管冷冻保护剂的临床应用情况，提到二甲基亚砜虽然有毒性，但目前还是血管组织库的主要保护剂。谭丽等梳理了不同冷冻保护剂在血管深低温保存中的研究进展，分析了渗透性和非渗透性保护剂各自的特点。龙俊东等测试了不同冷冻技术对同种异体血管移植排斥反应的影响，发现冻干法和玻璃化冷冻能降低免疫原性，减少排斥反应出现。蔡超操等对比了四种保护剂对人小口径动脉的保护效果，40%二甲基亚砜和40%甘油这两组的效果最佳。神经和肌腱组织的冷冻保存，能给周围神经损伤修复、肌腱移植提供材料。戴依娜测试了四种冷冻保护剂玻璃化保存人指固有神经的效果，发现30%乙二醇组的神经纤维结构保存得最完整，活细胞比例最高，神经生长因子的表达量也最高。张佩对比了四种保护剂玻璃化保存屈指深肌腱的效果，发现30%乙二醇组的羟脯氨酸含量最高，生物力学性能最好，更适合用来做肌腱的玻璃化保存。

3.3免疫细胞与干细胞的冷冻保存

细胞治疗里，免疫细胞、干细胞是核心载体，它们的冷冻保存质量会直接影响临床治疗的实际效果。

NK细胞和CIK细胞冷冻保存时，会出现活率、杀伤活性下降的问题。Kikuchi等用多种保护剂做NK细胞相关测试，结果显示二甲基亚砜浓度降低，会让NK细胞杀伤活性出现下降，而脯氨酸、海藻糖和葡聚糖40搭配使用，没法阻止这种下降，得找更好的保护方案。王清芳等测试了一款新型冷冻保护剂对多种免疫细胞、干细胞的冻存效果，该保护剂在细胞回收率、活率、表面标志物以及杀伤毒性上，和传统配方没有大的差异，有替换现有市售保护剂的可能。冷冻睾丸生精细胞，能给儿童期癌症患者保存生育力提供路径。张啸龙等对比不同冻存保护剂对未性成熟小鼠睾丸生精细胞的影响，发现10%二甲基亚砜+0.1mol/L蔗糖+0.1mol/L海藻糖+10%胎牛血清的组合，能让细胞活率达到最高、凋亡率降到最低，是比较合适的冷冻保护剂方案。

3.4其他生物样本的冷冻保存

除上述样本外，冷冻保护剂在其他生物样本中的应用也值得关注。

禽类红细胞带有细胞核，和哺乳动物的红细胞不一样，相关冷冻保存的研究比较少。Bissoyi等最先发现聚两性电解质能保护冷冻状态下的禽类红细胞，为有核红细胞实现长期保存找了新方向。粪菌移植技术里，肠道菌群的保存是核心环节。陈丽羽系统评价了多种肠道菌群保护剂，发现5%海藻糖，以及5%蔗糖+5%菊粉+1%半胱氨酸盐酸盐的复合保护剂，都能保护细菌活性，且复合保护剂对厌氧菌的保护效果更优，经其处理的供体菌群移植后，可在受体小鼠体内成功定植。海洋生物种质资源保护工作中，海带配子体和孢子的超低温保存是重要组成部分。钱瑞等测试了不同冷冻保护剂对海带配子体和孢子的毒性，得出10%二甲基亚砜对配子体的毒性最低，单一保护剂对孢子的毒性比复合保护剂小的结论，为海带种质资源保存积累了基础数据。

4讨论

4.1 冷冻保护剂研究的挑战与问题

尽管冷冻保护剂研究取得了显著进展，但仍面临多方面挑战。

先看保护剂的毒性问题。高浓度保护剂能实现玻璃化，避免冰晶损伤，但会带来不可忽视的化学毒性。二甲基亚砜是最常用的渗透性保护剂，它的细胞毒性在临床应用里需要特殊处理。研究人员当前重点关注的，是如何在维持保护效果的前提下，把保护剂浓度降下来。Shiyu Zhao等提出，低浓度保护剂的协同作用，或许能解决这一问题。不同细胞类型对保护剂的反应比较大，得用个体化优化方案。不管是生殖细胞还是体细胞，不管是单细胞悬液还是组织器官，保护剂的渗透条件、平衡时间、浓度梯度都要针对性优化。还要深入研究冷冻保护剂组合里各组分的相互作用，Kikuchi等发现海藻糖和葡聚糖40存在负相互作用，这说明复合保护剂不能简单混合来提升效果。大体积组织器官的冷冻保存还没找到成熟方案。组织器官有多层细胞结构和物质传递屏障，会让保护剂渗透不均，没法做到全面保护，赵恒等综述的过冷保存技术和纳米复温技术，为解决这一难题提供了方向。

4.2研究展望

基于现有研究进展，未来冷冻保护剂研究可从以下方向深入。

深共晶溶剂、聚两性电解质、抗冻蛋白等新型材料，在新型保护剂开发领域表现出比较大的应用潜力。这类材料的作用机制和传统保护剂不一样，能给低毒性、高效率的冷冻保存提供新方向。复合保护剂优化工作里，要重点关注依托分子机制设计的理性方案。Min Lin等搭建的相关性模型，能结合保护剂类型、浓度、体积和降温速率来预测成核温度，给定量控制冰晶形成提供理论支持。本文可进一步搭建保护剂结构与活性的关系模型，指导复合保护剂的筛选和优化。纳米辅助复温技术能解决大体积样本复温不均的问题，可结合到冷冻保护剂的应用中；微流控技术能精准完成保护剂的加载和洗脱，降低毒性影响；把抗氧化剂和冷冻保护剂一起用，能同时处理物理和化学损伤，提升冻存质量。针对不同细胞和组织，要建立标准化冷冻保存方案，明确保护剂的适用条件和质量控制标准，这是临床应用环节的核心工作。王清芳等研发的新型通用冷冻保护剂，为规模化、标准化应用打下了技术基础。

冷冻保存技术里，冷冻保护剂是最核心的部分，相关研究也从早期靠经验选品，转成现在结合作用机制的理性设计。搞清楚保护剂和细胞、水分子的互动逻辑，开发毒性低、效果好的新型保护剂，调整完善复合保护剂的搭配形式，再结合前沿工程技术手段，能让冷冻保存技术在生殖医学、再生医学和生物样本库建设等领域发挥比较大的作用。

参考文献：

1. [1] 龚俊.细胞冷冻保存研究进展[J].中阿科技论坛(中英文),2021(01):116-120.
2. [2] 赵恒,冯锦腾,于邦瑞,等.过冷保存技术在移植物保存中的应用研究进展[J].器官移植,2025,16(03):394-403.
3. [3] 尉国澳,肖霖力,白佳桦,等.牛胚胎超低温冷冻保存技术研究进展.黑龙江畜牧兽医,2025(05):68-74.
4. [4] 赵锦辉,卢婕,刘莹,等.羊精液冷冻保存损伤机制研究[J].黑龙江动物繁殖,2025,33(03):60-64.
5. [5] 邵乐,秦枫,朱慈根,等.兔精液冷冻保存研究[J].上海畜牧兽医通讯,2023(05):65-70.
6. [6] 张群,王骞,郭铭晖,等.猪精子冷冻损伤与保护剂的研究进展[J].猪业科学,2021,38(02):106-108.
7. [7] 陆清芳.在冷冻保护剂中添加MnTBAP对小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存的保护作用[D].广西大学,2023.
8. [8] 胡涛涛.猪卵巢皮质玻璃化冷冻技术的研究[D].华中农业大学,2023.
9. [9] 王清芳,张芬,昌广萍,等.一种新型冷冻保护剂冻存组织和细胞的效果[J].中国组织工程研究,2025,29(36):7816-7826.
10. [10] 王鐥,王成,史业弘.血管冷冻保护剂的临床应用[J].中国组织工程研究,2023,27(24):3920-3925.
11. [11] 蔡超操,陈世玖,王成,等.四种冷冻保护剂深低温保存人小口径动脉的实验研究[J].贵州医药,2021,45(07):1024-1029.
12. [12] 戴依娜.四种冷冻保护剂玻璃化法保存人指固有神经的实验研究[D].遵义医科大学,2021.
13. [13] 张佩.四种冷冻保护剂玻璃化保存屈指深肌腱的实验研究[D].遵义医科大学,2021.
14. [14] 陈丽羽.不同配方保护剂对肠道菌群保存效果的研究[D].桂林医学院,2023.
15. [15] 沙玲娜,陈耀平,徐仙.人类精子冷冻保存技术的研究进展[J].宁夏医学杂志,2025,47(05):455-459.
16. [16] 翟亚莹,张子敬,吕世杰,等.牛胚胎冷冻技术及冷冻保护剂研究进展[J].中国畜禽种业,2022,18(10):34-37.
17. [17] 李淼,李梅.人卵巢组织玻璃化冷冻技术研究进展[J].现代妇产科进展,2021,30(03):233-235.
18. [18] 谭丽,王成,陈世玖.不同冷冻保护剂在血管深低温保存中的研究进展[J].医学综述,2022,28(13):2625-2629.
19. [19] 龙俊东,史业弘,王成,等.不同冷冻技术对同种异体血管移植排斥反应的影响[J].中国组织工程研究,2024,28(03):433-438.
20. [20] 张啸龙,张杰平,王金玉,等.不同冻存保护剂对未性成熟小鼠睾丸生精细胞冻存的影响[J].生殖医学杂志,2022,31(03):366-372.
21. [21] 钱瑞,陈书秀,罗世菊,等.不同种类冷冻保护剂对海带配子体及孢子的毒性评价[J].水产科技情报,2023,50(04):224-229.