引言

糖尿病是系统性疾病，可累及全身多个器官脏器，导致各种并发症、功能障碍，甚至器官衰竭。其中约40%糖尿病患者并发糖尿病肾病（Diabetic nephropathy, DN），DN已成为引起全世界终末期肾病的主要原因，全球疾病负担显示糖尿病约占慢性肾脏病病因的1/3。鉴于此，寻求有效的预防和延缓DN进展的策略，已成为目前亟待解决的关键问题。细胞周期依赖性蛋白激酶5（Cyclin-dependent protein kinases5,Cdk5）的活性对维持足细胞的正常形态起重要作用。我们前期研究发现高糖可诱导足细胞产生p25，Cdk5/p25异常活化通过氧化应激、炎症反应等信号通路调节，导致足细胞结构和功能的破坏，凋亡增加。那么抑制Cdk5的活化是否可改善足细胞的损伤？我们将P35蛋白分解得到Cdk抑制短肽（Cdk5 inhibitory peptide, CIP），可特异性抑制Cdk5过度活化，但是由于CIP分子量大，不易在细胞内达到有效浓度，并且毒副作用较大，因此我们进一步进行酶切得到了CIP的C端24个氨基酸序列（Lys254-Ala277）短肽，将其命名为P5，并在P5短肽-C端连接一具有11个氨基酸的TAT蛋白（一种细胞穿透肽），N端连接FITC（一种绿色荧光蛋白）合成Cdk5特异性抑制短肽TFP5。进一步在足细胞中进行验证：TFP5通过抑制Cdk5的过度活化对NGF/SIRT1轴起调节作用，减少炎症因子分泌，抑制氧化应激反应，减轻细胞凋亡。为了进一步从表观遗传层面探讨糖尿病肾病足细胞损伤及TPF5对足细胞损伤的修复机制，我们将对照小鼠、糖尿病肾病小鼠、TFP5治疗小鼠的肾脏组织进行高通量全长转录组测序，寻找关键的lncRNAs并进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

高通量转录组测序肾组织取自对照组小鼠C57BLKS/J(n=5只)、糖尿病肾病小鼠(db/db+SCB) (n=5只)和TFP5治疗组小鼠db/db+TFP5（n=5只）。所有实验动物均购自南方模式生物科技股份有限公司，在SPF级环境中饲养。

1.1.2 实验细胞

本研究体外实验所使用的细胞为条件永生化小鼠肾足细胞（MPC-5），购自美国标准菌库（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.3主要试剂

TFP5、Scramble（货号：DL30－2381、DL20－2433，南京肽业公司），PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65抗体（货号：ab133616、ab283576、ab215206、ab232516，英国Abcam公司）；WT-1、Nephrin、TGF-β、BAX、Bcl-2抗体（货号：MA5-32215、MA562088、MA5-15065、MA5-14003、MA5-11757，美国赛默飞公司）；山羊抗鼠 IgG 二抗（货号：S0002，美国Affinity公司）；PrimeScript^TMRT、SYBR Premix试剂盒（货号：RR820A、RR036A，日本Takara公司）；引物，由上海生工设计合成。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组处理

本研究选取雄性db/db小鼠作为糖尿病肾病动物模型，选取相同遗传背景的C57BLKS/J小鼠作为对照组小鼠。购买7周龄的小鼠，进行1周的适应性喂养，分为3组：C57BLKS/J小鼠组、db/db小鼠+SCB（TFP5的无活性对照短肽）组，db/db小鼠+TFP5组，TFP5及SCB (200μM)短肽均于小鼠第8周起以150μl的剂量腹腔注射，每3天1次，共计16次，于第16周处死小鼠，收集肾脏，取部分肾组织0CT包埋，用于RNA 提取进行转录组测定。

1.2.2细胞实验分组及处理

分组：对照组（葡萄糖浓度5mM）、高糖组（葡萄糖毒性组30mM）、高糖+lncRNA Con(lnc MSTRG.31814.5过表达的阴性对照)组、高糖+lncRNA OE（lnc MSTRG.31814.5过表达）组、高糖+lncRNA Con +740 Y-P（30mM PI3K激动剂）组、高糖+lncRNA OE+740 Y-P（30mM PI3K激动剂）组。高糖+SCB (200nM))组、高糖+TFP5组(200nM))、高糖+SCB+740 Y-P（30mM PI3K激动剂）组、高糖+TFP5+740 Y-P（30mM PI3K激动剂）组。

1.2.3 转录组测定

构建lncRNA和mRNA文库，使用NEB Next® UltraTM RNA文库试剂盒；AMPure XP磁珠纯化文库片段；在Illumina平台进行高通量测序，获得150bp双末端序列；Perl脚本处理Fastq格式的原始数据(raw data)，删除含有接头的序列和低质量序列，获得高质量的分析数据(clean data)。

1.2.4 生物信息学分析

将长度>200bp的转录本以CPC分析、CNCI分析、CAPT 分析和pfam蛋白结构域分析共同预测 RNA 编码能力，删除具有编码功能的转录本，取4中分析交集获得差异表达的lncRNA。差异表达的lncRNA筛选标准：|log2FC|≥1 且 p-Value≤0.05(log2FC 即差异表达倍数再取以2为底的对数，log2FC≥1即为上调的差异基因，log2FC≤-1为下调的差异基因基因)。使用R(4.2.1版本)的"ClusterProfiler"包分析基因功能,包括生物学过程(BP)、细胞成份(CC)、分子功能(MF)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达水平

提取小鼠MPC-5细胞的蛋白，按照 BCA 浓度蛋白试剂盒说明书对每组样品进行蛋白定量。沸水中蛋白变性，上样，用凝胶进行电泳后，电转膜，封闭后，进行抗体孵育。分别加入 PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65、WT-1、Nephrin、TGF-β、BAX、Bcl-2一抗4 °C孵育过夜，次日洗膜后加入二抗常温孵育2h，显影成像并通过Image J软件分析条带灰度值。

1.2.6 qRT-PCR 检测mRNA表达水平

使用RNA吸附柱对各组细胞总RNA进行提取，计算A260/A280比值和总RNA浓度，A260/A280应在1.8-2.0之间。PCR引物由上海生物工程合成。逆转录反应：以提取的总RNA为模板，制反转录反应液，将tRNA逆转录为cDNA。

1.2.7统计学方法

本研究所有的统计及作图均使用GraphPad9.0软件，使用ImageJ软件分析免疫荧光及蛋白电泳条带的相对表达量。正态分布的实验数据结果使用均数±标准差表示，分析比较采用Independent Samples T-test或单因素方差One-Way ANOVA进行分析，P＜0.05，认为有统计学差异。

2结果

2.1 糖尿病肾病差异表达的lncRNA分析筛选

通过Illumina平台进行高通量转录组测序检测对照组小鼠、糖尿病肾病组小鼠、TFP5治疗组小鼠肾组织的mRNA和lncRNA。结果显示：糖尿病肾病组与对照组共鉴定出有1022个差异表达的lncRNA，其中在糖尿病肾病组有482个lncRNA表达上调，540个lncRNA表达下调（图1A）；糖尿病肾病组与TFP5治疗组共鉴定出321个差异表达lncRNA，其中在TFP5治疗组有160个lncRNA上调，161个lncRNA下调（图1B）。将上述分析结果进行聚类分析，绘制聚类热图将结果可视化，结果显示，对照组、糖尿病肾病组和TFP5治疗组聚类明显（图1C,D）。

为了进一步筛选参与TFP5治疗的关键lncRNA，我们筛选出5个差异倍数大，显著性高的lncRNA (ENSMUST00000211209, MSTRG.31814.5, MSTRG.28304.1, MSTRG.39790.16和MSTRG.45642.14)，构建lncRNA-mRNA通路共调控网络（图2 A-C）。

为了验证测序结果的可靠性，我们采用qRT-PCR检测上述5种差异表达lncRNA在小鼠肾脏组织中的表达情况（图3 A-E）。选择其中差异倍数大，显著性高的lncRNA MSTRG.31814.5为研究对象，依据上述lncRNA-mRNA共表达网络，通过差异表达基因KEGG富集分析发现与PI3K/Akt/NF-κB通路密切相关（图3 F）。

2.2过表达lncRNA MSTRG.31814.5上调了足细胞标志物WT-1、Nephrin的表达，下调了PI3K、Akt、NF-κB的表达

构建lncRNA MSTRG.31814.5过表达模型，进行细胞实验。细胞实验分为4组：对照组（葡萄糖浓度5mM）、高糖组（葡萄糖毒性组30mM）、高糖+lncRNA Con (lnc RNA MSTRG.31814.5过表达的阴性对照)组、高糖+lncRNA OE（lnc MSTRG.31814.5过表达）组。Western blot结果显示：高糖组WT-1、Nephrin表达水平明显下降，而PI3K、p-Akt、NF-κB的水平升高；高糖+lncRNA OE组与高糖组比较，WT-1、Nephrin表达水平上调，PI3K、p-Akt、NF-κB的水平下降。qRT-PCR结果与Western blot结果一致（图4 C,P＜0.05）。

2.3 lncRNA MSTRG.31814.5通过调控PI3K/Akt通路抑制足细胞的炎症及凋亡

在证实了过表达lncRNA MSTRG.31814.5可抑制PI3K/Akt/NF-κB通路活性后，我们选择了PI3K的激动剂740 Y-P对足细胞进行预处理，分为6组：对照组、高糖组、高糖+lncRNA Con组、高糖+lncRNA OE组、高糖+ lncRNA Con+740 Y-P（PI3K激动剂）组、高糖+ lncRNA OE +740 Y-P组。收集细胞检测炎症、凋亡因子的蛋白及核酸表达。结果显示：高糖组NF-κB、TGF-β、BAX的表达水平升高， Bcl-2表达下降；相较于高糖组，高糖+lncRNA OE组NF-κB、TGF-β、BAX表达水平下降，而Bcl-2表达水平升高；在给予PI3K通路激动剂740 Y-P处理后，NF-κB、TGF-β、BAX的表达较高糖组会进一步升高，Bcl-2表达水平下调，在此基础上过表达lncRNA MSTRG.31814.5后可下调PI3K通路激动剂导致的NF-κB、TGF-β、BAX的升高，上调Bcl-2的水平（图5 A-C，P＜0.05）。

2.4 TFP5通过上调lncRNA MSTRG.31814.5的表达抑制高糖刺激足细胞导致的炎症反应及凋亡

为了明确TFP5与lncRNA MSTRG.31814.5之间的关系，我们进行细胞实验，给予TFP5200nm处理后，应用qRT-PCR方法测定足细胞的lncRNA MSTRG.31814.5表达水平的改变。结果显示：予以TFP5处理后的足细胞lncRNA MSTRG.31814.5的表达水平高于高糖组（图6 A P＜0.05）。

为进一步验证TFP5通过lncRNA MSTRG.31814.5调控PI3K/Akt/NF-κB通路抑制炎症、凋亡，进行细胞实验：分为6组：对照组、高糖组，高糖+SCB组、高糖+TFP5组、高糖+SCB+740 Y-P组、高糖+TFP5+740 Y-P组。收集细胞检测炎症、凋亡因子的蛋白及核酸表达情况。结果显示：高糖组的NF-κB、TGF-β、BAX的表达水平升高，Bcl-2表达下降；相较于高糖组，高糖+TFP5组NF-κB、TGF-β、BAX表达水平下降，而Bcl-2表达水平升高。在给予PI3K通路激动剂740 Y-P处理后， NF-κB、TGF-β、BAX的表达较高糖组进一步升高，Bcl-2表达水平下调，在此基础上予以TFP5可下调PI3K通路激动剂导致的NF-κB、TGF-β、BAX的升高，上调Bcl-2的水平（图7 B-D，P＜0.05）。

3讨论

DN发病机制复杂，当前研究结果显示足细胞功能障碍、脱落和凋亡是DN发生蛋白尿、肾功能进展的重要原因。近年研究结果显示，炎症反应、氧化应激与细胞凋亡在DN足细胞损伤中呈现复杂的交互作用，其核心机制涉及多条信号通路的协同失衡。

我们课题组在前期的研究中发现：Cdk5/P25异常活化导致的微炎症反应、氧化应激是DN足细胞损伤的主要原因，TFP5可有效地抑制Cdk5/p25的活性，抑制氧化应激反应，减少炎症因子的产生^[5]。为了进一步从转录水平探讨DN足细胞损伤及TPF5对足细胞损伤的修复机制，我们通过全长转录组测序及生物信息学分析，得出了差异表达的lncRNA MSTRG.31814.5。因此，我们推测lncRNA MSTRG.31814.5在DN足细胞损伤中具有重要调控作用，并且可能参与了TFP5对DN足细胞损伤的保护机制。

通过差异表达基因KEGG富集分析发现lncRNA MSTRG.31814.5与PI3K/Akt/NF-κB通路密切相关。既往文献报道，PI3K/Akt/NF-κB信号通路与DN发病关系密切^[12]，高糖可通过激活PI3K/Akt/NF-κB通路诱导足细胞损伤、系膜细胞肥大、肾小管上皮细胞转分化。PI3K/Akt/NF-κB信号通路可通过调控炎症反应及细胞凋亡在DN中发挥重要作用。关于PI3K/Akt/NF-κB通路与DN足细胞损伤的机制方面的研究，目前的证据表明，PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活可显著增加下游炎症细胞因子从而引发肾脏炎症并加速DN的发展。在DN进展过程中，持续性高血糖通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号轴，驱动巨噬细胞介导的炎症级联反应。Feng等人通过RNA-seq分析，证实连翘苏可通过调节TLR4/MyD88/NF-κB通路以及PI3K/Akt/GSK3β通路减轻高糖诱导的系膜细胞炎症和凋亡，改善肾功能，减轻肾组织损伤。Yang等研究结果显示，黄芪-蝉拟青霉固态发酵物可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促进细胞自噬，保护足细胞。

我们通过体外实验证实：过表达lncRNA MSTRG.31814.5抑制高糖导致的足细胞PI3K/Akt通路活性，并验证TFP5通过lncRNA MSTRG.31814.5调控PI3K/Akt/NF-κB信号通路抑制炎症及凋亡反应，起到保护足细胞的作用。

综上，我们通过高通量转录组测序，寻找与糖尿病肾病发病机制密切相关的lncRNA MSTRG.31814.5，并证实TFP5可上调其水平进一步抑制高糖导致的足细胞PI3K/Akt/NF-κB通路的活性，减轻炎症及凋亡反应，起到保护足细胞的作用，为糖尿病肾病的有效防治提供新的思路并提供理论依据。

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