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脾多肽协同EGFR-TKI对晚期非小细胞肺癌免疫功能影响及疗效观察
Effects of Lienal Polypeptide Injection combined with EGFR-TKI Therapy on Immune Function and Clinical Efficacy in Advanced NSCLC
引言
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)分为不同的分子亚型，其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变是最常见的亚型。以吉非替尼为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor， EGFR-TKI）显著延长了晚期NSCLC患者的总体总生存期，并明显改善了患者的生活质量。EGFR-TKI已被推荐作为携带EGFR突变的晚期NSCLC患者的一线治疗。然而，相当一部分患者由于不良反应无法耐受而被迫停药，继而导致疾病进展和治疗失败。
最近研究发现EGFR-TKI可以调节T淋巴细胞和自然杀伤细胞，解除对癌变的调控。然而，EGFR-TKI诱导的慢性炎症反应导致炎症细胞大量浸润和细胞因子水平升高。这种充满慢性炎症细胞和炎症介质的肿瘤微环境可能导致肿瘤细胞基因沉默或异常表达、表观遗传改变、修复酶失活错配、DNA损伤或基因突变，最终导致肿瘤细胞恶性转化和耐药[7]。脾多肽(Lienal polypeptide, LP)从健康犊牛的脾脏中提取，具有免疫调节剂的作用，能够纠正免疫功能障碍，激活非特异性免疫功能，改善淋巴细胞功能，增强机体对感染的防御能力。目前脾多肽广泛用于免疫抑制性疾病和恶性肿瘤中放化疗相关不良反应的辅助治疗，并可改善癌症患者恶液质状态。然而，关于EGFR-TKI治疗过程中联用脾多肽的相关研究鲜有报道。
因此，为了探讨脾多肽在EGFR-TKI治疗过程中的作用，本研究回顾性分析了99位携带EGFR敏感突变的晚期NSCLC患者临床病理特征和治疗相关信息，分析了脾多肽对晚期NSCLC患者运用EGFR-TKI治疗过程中的免疫功能水平变化、临床疗效以及不良反应发生的影响。另外，我们利用肺癌细胞系进行了一些列细胞生物学实验探索了脾多肽调节EGFR-TKI疗效的相关机制。本研究为晚期肺癌患者使用靶向治疗过程中辅助使用脾多肽注射液提供了丰富的理论基础，具有一定的的临床意义和实用价值。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选择2019年1月1日至2022年12月31日期间在江苏省人民医院接受EGFR-TKI联合化疗的晚期驱动基因阳性NSCLC患者作为回顾性分析对象。纳入标准：经组织病理学或细胞学检查确诊的NSCLC；年龄18岁-80岁（包括18岁和80岁）；临床分期：IIIB期、IV期；EGFR驱动基因阳性，包括EGFR 19DEL突变或EGFR 21L858R突变；一线使用EGFR-TKI治疗；至少有1个可测量病灶； ECOG 评分0-2分；血常规、血生化等实验室检查符合要求。排除标准：对EGFR-TKI药物过敏且不能耐受导致治疗中断；对脾多肽注射液成分过敏；预期生存期≤3个月；伴发其他部位原发恶性肿瘤病史；患有其他系统恶性疾病；合并严重的心血管疾病、内分泌系统疾病、自身免疫性疾病、或血液系统疾病等； 妊娠期、哺乳期女性。
1.2 实验材料
1.2.1 细胞培养
PC9、 PC9/GR细胞使用DMEM高糖完全培养基培养。完全培养基由DMEM、10% FBS、100U/ml青霉素和100mg/L链霉素组成。细胞常规放置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养。
1.2.2 实验试剂
脾多肽注射液（2ml/支，吉林丰生制药有限公司）；吉非替尼（Gefitinib，品牌MCE，货号MCE HY-50895-1 g）；高糖DMEM培养基（美国Gibco公司，货号C11995500BT）；特级胎牛血清（Certified Fetal Bovine Serum，FBS，品牌Biological Industries，货号04-001-1A）；青链霉素双抗（品牌biosharp，货号YZ-00-0514）；CCK8试剂盒（品牌biosharp，货号CCK8-BS350B）；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，品牌Biofroxx，货号DMSO-1084ML500）； BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒（品牌碧云天，货号C0071S）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 （品牌碧云天，货号C1062S）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，品牌索莱宝，货号B824162-100g）。
1.3 研究方法
1.3.1 疗效评估方法
治疗3个疗程后，根据RESIST评估标准将治疗疗效分为疾病进展（Progress Diesease，PD）、疾病稳定（Stable Diesase, SD）、部分缓解（Partial Response, PR）和完全缓解（Complete Response, CR）。客观缓解率（Overall Response Rate，ORR）=（PR+CR）例数总例数100%。
1.3.2 免疫功能检测方法
治疗后采集患者空腹静脉血，运用流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群百分比，具体包括CD3+T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞、NK细胞、调节性T细胞（Treg），以及CD4+/CD8+比值。
1.3.3 血清指标检测方法
采集患者外周静脉血，离心得到血清。肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、糖类抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4， CA72-4）、细胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment cyfra21 1 ，CYFRA21-1）和神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）采用免疫化学发光试剂盒检测。生化指标谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、血清白蛋白（albumin，ALB）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，Cr）的含量采用全自动生化分析仪器检测。
1.4 实验方法
1.4.1 IC50 实验
对数生长期细胞消化重悬计数，以5000个/孔的密度种于96孔板中。根据实验设置6个药物浓度梯度，使用完全培养基对溶解于DMSO的吉非替尼药液或脾多肽注射液进行稀释。每组设置5个复孔，根据实验设计加入200ul含不同浓度药物的培养基继续培养48小时。培养结束后采用CCK8法检测细胞活力。IC50即细胞活力为对照组（不加药组）细胞活力的一半时所对应的浓度。
1.4.2 克隆形成实验
对数生长期细胞消化重悬计数，以1000个/孔的密度接种于6孔板中。待细胞完全贴壁后根据实验设计更换加药的完全培养基，作用24小时后用PBS润洗2次，洗去残留药物，更换新鲜完全培养基继续培养。每3天更换一次新鲜完全培养基。待形成肉眼可见的细胞克隆团后结束培养。去除培养基后，加入4%多聚甲醛，固定15分钟，随后结晶紫溶液染色30分钟。清洗干净，自然晾干后拍照计数。
1.4.3 EdU实验
对数期生长细胞，以3000个/孔的密度铺于96孔板中。根据实验设计处理48小时后，弃去培养基，每孔加入按1000:1的比例稀释过的EdU溶液100μl继续孵育2小时。弃培养基，使用含3% BSA的PBS洗涤5分钟。每孔加入100ul细胞固定液固定15分钟。弃固定液，用洗涤液（含3% BSA的PBS）洗涤3次，每次5分钟。洗涤后用含0.3%TritonX-100的PBS室温通透15分钟。每孔加入50μl click反应液（依照说明书配制），室温避光孵育30分钟。吸除Click反应液，洗涤3次，每次5分钟。加入50μl 1×Hoechst33342 反应液，室温避光孵育10分钟。最后，用洗涤液清洗3次，每次5分钟，荧光显微镜镜下拍照，计算细胞增殖比例。
1.4.4 细胞划痕实验
取六孔板，先用记号笔在6孔板背后根据三等分间距画三条水平线。每孔接种2×105个细胞，培养直至细胞生长汇合率为100%，随后用200μl枪头垂直于孔板底部的水平线，在孔内画三条直线，直线之间距离约为0.5至1cm。PBS润洗3遍，每孔加入2ml不含PBS的基础培养基，拍照记录初始划痕状态，细胞培养24小时后再次拍照记录细胞迁移状态，用ImageJ计算细胞迁移率。细胞迁移率 = （初始划痕面积-24小时后的划痕面积）/初始划痕面积×100%。
1.4.5 Transwell 实验
取24孔板，铺放小室，用50μg Matrigel 基质胶均匀铺布小室内面底部，至细胞培养箱中静置30min成胶，随后用含 0.2% BSA 的 DMEM 培养基封闭30 min待用。细胞用胰酶消化后用无PBS培养基重悬，以2万个/孔的密度种于Transwell小室上室，下室加入750 μl含10% FBS的完全培养基，继续培养24小时。小室用PBS清洗一遍，放入4%多聚甲醛液中固定15分钟，随后使用结晶紫染色30分钟。用PBS清洗干净后，使用棉签将小室内侧细胞擦净并自然晾干。拍照计数。细胞侵袭率=处理组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数× 100%。
1.4.6 流式细胞术
细胞培养48小时后吸取培养液，收集至流式管中。PBS清洗一遍后，使用不含EDTA的胰酶进行细胞消化。使用各组对应的原来培养液终止消化，4℃，1000rpm离心5分钟，弃上清。用预冷的PBS清洗细胞两遍。加入100 μl 1×Binding Buffer重悬至单细胞状态，再加入5 ul Annexin V-FITC和10 μl PI Staining Solution，吹匀后室温避光孵育10分钟。最后加入400 μl 1×Binding Buffer轻柔混匀，1小时内使用流式细胞仪进行检测。
1.5 统计学方法
采用GraphPad Prism 8.0或SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。实验数据使用GraphPad Prism 8软件处理，结果以三次平行实验的均值±标准差（Mean±SD）表示，组间差异使用双尾Student’s T检验。临床计数资料采用χ2检验，计量资料符合正态分布，治疗前后对比采用配对样本T检验，组间对比采用独立样本T检验，结果以均数±标准差（Mean±SD）表示。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 临床资料
该研究共纳入99人，患者根据是否使用脾多肽注射液治疗分为治疗组和对照组。对照组纳入49人，接受口服EGFR-TKI治疗，患者中位年龄63岁；男性22人，女性27人；IIIB期8人，IV期41人；EGFR 19DEL突变28人，EGFR 21L858R突变21人。治疗组在对照组的基础上用脾多肽注射液治疗，具体为8ml脾多肽注射液加入至500ml 0.9%氯化钠注射液或500ml 5%葡萄糖注射液内稀释后，静脉滴注，每日1次，3-5天一疗程，共治疗3个疗程。治疗组患者50人，中位年龄61岁；男性24人，女性26人；IIIB期13人，IV期37人；EGFR 19DEL突变21人，EGFR 21L858R突变29人。患者详细临床特征见表1。
| Characteristic | Control Group | Treatment Group | P |
|---|---|---|---|
| Sex,n | 0.852 | ||
| Female | 27 | 26 | |
| Male | 22 | 24 | |
| Age,years | 0.564 | ||
| ＜65 | 29 | 33 | |
| ≥65 | 20 | 17 | |
| Median age,years | 63 | 61 | |
| TNM Stage,n | 0.424 | ||
| IIIB | 8 | 13 | |
| IV | 41 | 37 | |
| EGFR mutation,n | 0.265 | ||
| 19DEL | 28 | 21 | |
| 21L858R | 21 | 29 | |
| EGFR-TKIs,n | 0.624 | ||
| Gefitinib | 8 | 12 | |
| Icotinib | 25 | 23 | |
| Afatinib | 2 | 1 | |
| Osimertinib | 14 | 14 | |
| Total,n | 49 | 50 |
2.2 两组的临床疗效及不良反应对比
治疗组客观缓解率为30%（15例/50例），高于对照组12.24%(6例/49例），差异具有统计学意义(χ2= 4.668，P = 0.048) （表2）。治疗过程中，治疗组共有4例发生3-4级不良反应，其中骨髓抑制3例，严重腹泻1例；对照组共有11例发生3-4级不良反应，其中骨髓抑制5例，严重腹泻2例，严重肝功能异常4例，但两组差异分析无统计学意义(χ2= 4.019，P = 0.054)（表3）。
| Group | PD | SD | PR | CR | ORR |
|---|---|---|---|---|---|
| Control (n=49) | 7(14.29%) | 36(73.47%) | 6(12.24%) | 0(0%) | 6(12.24%) |
| Treatment(n=50) | 2(4.00%) | 32(64.00%) | 14(28.00%) | 1(2.00%) | 15(30.00%) |
| Group | Myelosuppression | Hepatic disfunction | Diarrhea |
|---|---|---|---|
| Control (n=49) | 5(10.2%) | 4(8.16%) | 2(4.08%) |
| Treatment(n=50) | 3(6%) | 1(2%) | 0(0%) |
2.3 血清免疫指标比较
治疗前两组患者血清淋巴细胞亚群各组分比例无明显差异（P＞0.05）。治疗后对照组CD3+、CD4+细胞比例下降，CD4+/CD8+比值降低，CD8+和NK细胞比例有所上升（P＜0.05）。治疗组CD3+、CD4+细胞比例和CD4+/CD8+比值明显上升，B细胞和NK细胞比例有所下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。治疗后两组各项淋巴亚群对比提示脾多肽治疗组CD3+、CD4+细胞和CD4+/CD8+比值明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表4）。
| Lymphocyte subgroups | Control Group (n=49） | Treatment Group （n=50) | Comparison between groups | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Before | After | Before | After | t | P | ||
| CD3+ (%) | 69.729±10.043 | 62.924±12.426a | 68.743±8.765 | 75.667±7.09 a | 11.684 | 0.000 | |
| CD4+ (%) | 43.748±9.924 | 34.11±10.001 a | 39.057±8.854 | 45.846±8.057a | 9.719 | 0.000 | |
| CD8+ (%) | 22.542±7.088 | 24.984±7.752 a | 25.608±8.096 | 26.048±7.011 | -1.930 | 0.057 | |
| B (%) | 9.678±4.561 | 10.048±4.471 | 12.311±7.053 | 10.881±5.31 a | -2.057 | 0.042 | |
| NK (%) | 17.193±9.958 | 24.462±11.788a | 16.554±8.153 | 11.875±5.188a | -7.912 | 0.000 | |
| Treg (%) | 8.639±2.176 | 8.158±1.705 | 8.922±1.988 | 9.664±4.001 | 0.346 | 0.730 | |
| CD4+/CD8+ | 2.226±1.183 | 1.521±0.747 a | 1.732±0.76 | 1.953±0.824 a | 5.688 | 0.000 | |
注：a表示治疗后与治疗前对比差异具有统计学意义（P＜0.05）。
2.4 血清生化功能指标比较
治疗后两组患者血清中 ALT、AST、LDH、GGT、AKP、ALB、Cr、BUN 水平比较变化微小，差异无统计学意义（P＞0.05）（表5）。
| Indicators | Control Group (n=58） | Treatment Group （n=58) | Comparison between groups | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Before | After | Before | After | t | P | ||
| ALT (U/L) | 23.11±12.68 | 30.939±25.185 | 26.545±25.954 | 27.894±19.642 | -1.186 | 0.239 | |
| AST (U/L) | 25.439±11.166 | 32.31±14.405 | 26.751±13.387 | 32.247±14.35 | -0.403 | 0.688 | |
| LDH (U/L) | 198.83±61.325 | 219.106±43.519 | 233.898±131.239 | 210.939±47.945 | -1.639 | 0.105 | |
| GGT (U/L) | 33.774±30.173 | 36.832±27.156 | 35.837±29.998 | 46.124±40.803 | 1.169 | 0.245 | |
| AKP (U/L) | 125.523±38.323 | 91.979±30.579 | 95.878±47.753 | 92.651±68.841 | 1.606 | 0.112 | |
| ALB (g/L) | 109.477±63.966 | 40.157±3.384 | 39.216±3.202 | 38.443±3.822 | -1.669 | 0.098 | |
| BUN(mmol/L) | 36.81±6.222 | 5.759±1.835 | 5.391±1.3 | 6.93±11.891 | 0.614 | 0.540 | |
| Cr (μmol/L) | 5.279±1.784 | 67.612±15.833 a | 64.328±12.21 | 66.921±14.409 | -1.516 | 0.133 | |
2.5 血清肿瘤标志物对比
无论是治疗组还是对照组，两组治疗后外周血肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA72-4、CYFRA21-1、NSE总体变化无明显趋势，差异不具有统计学意义（P＞0.05）（表6）。
| indicators | Control Group (n=58） | Treatment Group （n=58) | Comparison between groups | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Before | After | Before | After | t | P | ||
| CEA （ng/mL） | 51.235±92.586 | 28.653±92.555 | 20.114±47.016 | 27.157±77.807 | 1.879 | 0.063 | |
| CA19-9（U/mL） | 31.545±98.804 | 17.132±18.066 | 16.261±16.452 | 16.54±14.142 | 1.092 | 0.278 | |
| CA72-4（U/mL） | 9.218±13.227 | 15.057±25.829 | 4.223±5.103 | 5.372±6.12 | -1.667 | 0.099 | |
| CYFRA21-1
（ng/mL） |
4.533±5.819 | 3.076±3.671 | 9.257±38.447 | 3.559±3.543 | -0.752 | 0.454 | |
| NSE（ng/mL） | 20.984±6.649 | 18.323±6.19 | 20.219±7.867 | 17.041±4.537 | -0.308 | 0.759 | |
以上研究结果初步表明联合使用脾多肽可增加EGFR-TKI抗肿瘤治疗疗效。为了探索脾多肽对含EGFR突变肺癌的作用机制，本研究进一步运用EGFR-TKI敏感肺癌细胞系PC9细胞系（含EGFR19 DEL突变）以及对应耐药细胞系PC9/GR细胞系（不含T790M突变）进行了一些列细胞生物学实验。
2.6 脾多肽对肺癌细胞活力的影响
不同浓度的脾多肽对PC9、PC9/GR细胞系均表现出明显的生长抑制作用，且这一效应呈剂量依赖性。此外，与敏感细胞相比，耐药细胞对脾多肽的耐受性相对更高。这可能与耐药细胞本身具有更高的生长能力和侵袭特性有关（图1和表7）。
| Cell line | the IC50 value of LP(mg/ml) | |
|---|---|---|
| PC9 | PC9/GR | |
| IC50 | 0.799 | 0.881 |
| 95% CI | 0.764 to 0.835 | 0.842 to 0.922 |
2.7 脾多肽增加PC9/GR细胞对吉非替尼的敏感性
为了探索脾多肽对EGFR-TKI疗效的影响，本研究选择分析了脾多肽同期处理下的PC9/GR细胞对吉非替尼敏感性变化，结果表明脾多肽可明显增加耐药细胞对吉非替尼的敏感性。在1mg/ml脾多肽处理下，细胞IC50由23.59μM下降至1.76μM，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图2和表8）。
| the IC50 value of Gefitinib(uM) on PC9/GR cells | ||
|---|---|---|
| Group | blank | LP（1mg/ml） |
| IC50 | 23.59 | 1.76 |
| 95% CI | 17.540 to 31.800 | 0.713 to 4.420 |
2.8 吉非替尼联合脾多肽可抑制PC9/GR细胞生长侵袭，诱导凋亡
接着，为了分析脾多肽对耐药细胞生物学行为的影响，我们进行了一系列克隆形成实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验以及凋亡分析实验。结果表明单用脾多肽可抑制耐药细胞生长、迁移、侵袭，并诱导凋亡；而吉非替尼联合脾多肽可进一步增加上述抗肿瘤效应（表9）。这与本研究临床患者中联合使用脾多肽具有更高的肿瘤疾控率相吻合。以上结果表明，脾多肽联合EGFR-TKI具有协同增效抗肿瘤作用。
| biological behavior | blank | LP | Gefitinib | Gefitinib + LP |
|---|---|---|---|---|
| Colony formation rate(%) | 100±0 | 76.135±3.903a | 64.079±2.937 | 47.911±4.258b |
| Invading rate(%) | 100±0 | 75.869±3.081a | 41.881±1.780 | 24.888±0.957 b |
| Wound healing rate | 100±0 | 75.688±2.892a | 27.421±2.378 | 16.611±2.128 b |
| Cell apoptosis rate | 5.230±0.348 | 6.727±0.793a | 14.233±0.766 | 17.307±0.718 b |
注:a表示与空白对照组相比P＜0.05，b表示与吉非替尼单药组相比P＜0.05。
3 讨论
EGFR-TKI靶向治疗是携带EGFR突变的晚期NSCLC患者标准治疗方案。而对于部分年龄较大，合并其他临床合并症的患者，靶向治疗可能会加大不良反应的发生率，从而降低患者生存质量，削弱患者的治疗依从性而影响疗效。稳固的免疫功能使患者更大程度的耐受药物联合治疗，从而更大程度的从治疗中获益。
脾多肽作为免疫调节剂，现已广泛用于免疫抑制性疾病和恶性肿瘤的辅助治疗，可显著改善机体免疫内环境，调节免疫细胞活性与增殖，减少癌症或治疗相关的疼痛和不良反应。既往多项临床研究说明，与未使用脾多肽组相比，脾多肽联合放化疗治疗组CD3+、CD4+ 、CD8+及NK 细胞有所升高，差异有统计学意义，证明了脾多肽能改善机体的细胞免疫功能，减轻放化疗的毒副作用。一项脾多肽联合化疗治疗晚期胃癌的研究发现，脾多肽可增强巨噬细胞的吞噬功能及NK细胞的细胞毒活性，促进细胞因子分泌和T淋巴细胞增殖，辅助杀伤肿瘤细胞，具有减毒增效作用。同时研究发现，脾多肽可通过抑制糖酵解过程，使肿瘤细胞代谢过程发生障碍，从而阻止G0、G1期细胞向增殖、分裂期发展，从而发挥抗肿瘤效果。上述结果提示，脾多肽的辅助使用对手术、放疗、化疗等抗多种肿瘤治疗手段具有较好的协同增效作用。
我们的研究显示，晚期NSCLC患者在EGFR-TKI治疗过程中，联用脾多肽可显著提高患者体内CD3+、CD4+T细胞水平，CD4+/CD8+比值也明显升高。众所周知，CD3+ T细胞代表机体整个免疫细胞水平，正常情况下CD4+/CD8+比值大于1，该比值越大，辅助性T细胞越多，相应的抑制性T细胞越少，反映了较好的免疫状态。此外，CD4+/CD8+比值升高被认为是非小细胞肺癌的独立预后因素[13]。本研究结果提示，联合脾多肽治疗组具有更高的ORR，患者发生治疗相关不良反应的概率更小，随后，我们运用基础实验进一步验证了脾多肽的辅助抗癌作用。我们创新性地发现脾多肽具有协同抗肿瘤作用，可增强EGFR-TKI的疗效。脾多肽联合吉非替尼对肿瘤细胞生物学行为表现出更为显著的抑制作用。在脾多肽的联合处理下，吉非替尼耐药肺癌细胞对吉非替尼更加敏感，二者联合可更大程度的抑制耐药细胞增殖、侵袭和迁移能力，并进一步诱导细胞凋亡。既往一项以小鼠肺癌模型为基础的环磷酰胺与脾多肽联合治疗的研究指出，脾多肽本身不具有直接抗肿瘤作用，但与环磷酰胺联合使用时表现出比单用环磷酰胺更强的协同增效抗癌的现象。这可能是由于脾多肽通过刺激和激活肿瘤微环境中的淋巴细胞来改善免疫抑制性的肿瘤微环境造成的。这一定程度上解释了本研究中治疗组和对照组之间的差异。
不可否认，本研究仍存在以下不足：首先，本研究为单中心回顾性研究，患者数量有限，从而造成样本量较小。其次，同时，本研究中的数据收集主要通过住院病例资料检索和电话随访核对追踪，数据分析可能存在一定偏倚。因此，该研究结论也许需要更大的样本量以及前瞻性临床试验加以验证。
综上所述，在晚期NSCLC患者中，EGFR-TKI治疗过程中辅助使用脾多肽在改善机体免疫紊乱和治疗效果方面均有提升作用，具有重要的实用价值和临床实际意义。
【参考文献】
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